Посмотри в мои глаза

В поисках быстрого и удобного способа диагностики аутоиммунных поражений малых нервных волокон ученые СПбГУ решили взглянуть в конфокальный микроскоп на роговицу человека.

Наталия Юрьевна Гаврилова, ассистент СПбГУ (кафедра факультетской терапии), врач-невролог Санкт-Петербургского научно-исследовательского института фтизиопульмонологии, вместе с коллегами из лаборатории мозаики аутоиммунитета СПбГУ продолжает изучать способы выявления нейропатии малых волокон (поражение клетками собственного иммунитета тоненьких нервных волокон, пронизывающих все внутренние органы и ткани, из-за чего возникают различные неврологические симптомы.

«Здоровый доброволец»: параллельные друг другу прямые стволы нервных волокон (толстые линии) с небольшим количеством ветвей (тонкие линии), мало клеток Лангерганса (белые бесформенные точки).
«Здоровый доброволец»: параллельные друг другу прямые стволы нервных волокон (толстые линии) с небольшим количеством ветвей (тонкие линии), мало клеток Лангерганса (белые бесформенные точки).

В 2019 году ученые уже исследовали возможности метода, который наиболее часто используется в диагностике этой патологии, — биопсии кожи. «Несмотря на то, что биопсия кожи считается "золотым стандартом" для выявления аутоиммунных патологий малых нервных волокон, она имеет ряд недостатков, — рассказывает Наталия Гаврилова. — Во-первых, эта процедура предполагает взятие биоматериала, то есть фактически маленького кусочка кожи пациента, что может быть опасно. Во-вторых, при биопсии невозможно провести контрольное исследование. Так как на раненом участке отрастает другая кожа, в следующий раз нужно брать кусочек с нового участка, где расположение нервных волокон может не совпасть с расположением на предыдущем участке. В-третьих, для этой процедуры необходим опытный специалист, который сможет качественно провести необходимые тесты. Наконец, в-четвертых, методика до сих пор окончательно не стандартизирована. То есть нет единых правил проведения процедуры, соблюдая которые можно сделать точное заключение по результату. Конечно, есть исследовательские данные о том, что биопсию можно проводить на коже лодыжки. Но поражения малых нервных волокон имеют рассеянный характер. Поэтому если у пациента нейропатия выражена на лице, биопсия кожи лодыжки вряд ли поможет ее выявить. Исходя из всего перечисленного, есть необходимость искать новые методы диагностики».

Новый метод

Команда специалистов СПбГУ занялась изучением метода конфокальной микроскопии роговицы глаза. Ученые намерены разобраться, возможно ли использовать его в качестве дополнительного или основного способа обнаружения аутоиммунных поражений малых нервных волокон.

Конфокальная микроскопия роговицы глаза позволяет заметить самые незначительные изменения в малых нервных волокнах и не требует вмешательства в организм пациента. Также она безболезненна, ее можно проводить несколько раз. Например, чтобы проследить динамику на фоне лечения. Кроме того, если голень имеет большую площадь поверхности кожи и в одном ее участке можно найти поражение, а в другом нет, то роговицу исследователи видят полностью, да еще и имеют возможность оценить ее состояние в двух глазах. Единственным недостатком метода конфокальной микроскопии является то, что с ее помощью невозможно количественно оценить концентрацию цитокинов и факторов воспаления в тканях, которые играют существенную роль в развитии аутоиммунных процессов. Однако на снимках с микроскопа хорошо прослеживаются клетки Лангерганса (разновидность иммунных клеток, содержащихся в эпителиальных тканях. — Прим. ред.). На основании их числа ученые могут судить о наличии или отсутствии воспалительного процесса и при необходимости провести дополнительные анализы.

Подробнее об исследовании с использованием биопсии кожи в диагностике саркоидоза читайте в статье «И прекрасен, и опасен наш иммунитет» (журнал «Санкт-Петербургский университет» № 05–06 за 2019 год).

«В конфокальной микроскопии используется методика совмещения двух линз. Первая линза располагается на живом объекте, в нашем случае это роговица глаза пациента. Во вторую линзу смотрит исследователь. В момент совмещения двух оптических лучей с каждой из линз мы получаем живую 3D-картинку в реальном времени, — рассказывает Мария Лукашенко, студентка шестого курса СПбГУ (программа "Лечебное дело"), участница исследования. — Используя метод конфокальной микроскопии, можно применять различные модули, которые позволяют лучше разглядеть тот или иной объект. Например, в нашем исследовании мы пользуемся специальным ретинальным модулем. С его помощью мы изучаем изображения всех пяти слоев роговицы».

Сам метод заключается в следующем. Сначала ученый делает снимок роговицы пациента. Затем ведет подсчет по четырем главным показателям: длине нервного волокна, толщине волокна, количеству ветвей, отходящих от ствола волокна, их извитости и глубине изображения. На основании результатов исследователь делает вывод о степени поражения малых нервных волокон. По словам Марии Лукашенко, сначала ученые проводили подсчеты самостоятельно, увеличивая снимок с помощью Adobe Photoshop, что занимало три часа. Затем им удалось связаться с исследователем из филиала биомедицинского подразделения Корнеллского университета в Катаре (Weill Cornell Medicine — Qatar) профессором Райазом Маликом, который уже давно занимается конфокальной микроскопией глаз. Профессор помог ученым СПбГУ освоить специальную программу для подсчета малых волокон на снимке, и теперь эта процедура занимает совсем немного времени.

«Программа профессора Малика присваивает каждому из четырех главных показателей свой коэффициент. Необходимо просто промаркировать нужные участки, и программа выдаст результат в цифрах. Конечно, надо подчеркнуть, что программа рассчитана на людей, которые имеют экспертные навыки и знания для работы с ней, — отмечает Наталия Гаврилова. — В настоящее время команда профессора Малика разрабатывает новый алгоритм, уже на основе искусственного интеллекта. Это позволит ускорить процедуру и упростить задачу исследователя. Например, специалисту больше не придется маркировать снимок».

Сложный диагноз

Ученые работают с пациентами с фибромиалгией и синдромом хронической усталости. В первом случае у людей возникают симметричные скелетно-мышечные боли. Во втором — измождение и усталость, а также ряд сердечно-сосудистых нарушений. На первый взгляд, это совершенно разные патологические ситуации. Однако исследователи уже на начальном этапе работы обнаружили между ними сходства. Малые нервные волокна оплетают сосуды и помогают регулировать процесс кровоснабжения тканей. Также малые волокна участвуют в передаче болевых импульсов. Таким образом, их поражение клетками собственного иммунитета может приводить и к болям, и к появлению ортостатических симптомов, таких как головокружение, часто возникающее при синдроме хронической усталости.

«Пациент с синдромом хронической усталости»: стволов волокон только два, они извитые и имеют очень много разрозненных ветвей, много клеток Лангерганса.
«Пациент с синдромом хронической усталости»: стволов волокон только два, они извитые и имеют очень много разрозненных ветвей, много клеток Лангерганса.

«Поскольку и фибромиалгия, и синдром хронической усталости плохо изучены, врачи не любят ставить эти диагнозы. Поэтому пациенты переходят от одних специалистов к другим, что затрудняет их лечение. Особенно страдают люди с синдромом хронической усталости. Обычно такие пациенты проходят большое количество тестов и исследований, но в результате все показатели оказываются в пределах нормы. К тому же по их внешнему виду сложно сказать, что они страдают от заболевания. Пациенты не испытывают болей, их жалобы связаны только с головокружением и перепадами пульса при смене положения тела. Например, когда они встают, их пульс может увеличиваться до 120 ударов в минуту, — рассказывает Наталия Гаврилова. — Поэтому в рамках нашей работы мы также надеемся параллельно уточнить клинические критерии для постановки обоих диагнозов». Это, по словам ученого, необходимо еще и для того, чтобы люди с фибромиалгией смогли претендовать на получение инвалидности: из-за сильной боли, которую не всегда удается купировать лекарствами, пациентам тяжело работать. Определение морфологических критериев и постановка диагноза стали бы весомым аргументом для внесения их заболевания в перечень болезней, при которых присваивают инвалидность.

Работа на перспективу

В планах ученых обследовать пациентов посредством большого количества различных способов. Они уже опросили добровольцев с помощью специальных стандартизированных анкет и готовятся к процедуре биопсии кожи и забору крови для выявления показателей иммунитета. Также они проведут и другие тесты, например аудиометрию — измерение остроты слуха и чувствительности к разным звуковым волнам, что тоже связано с функциями малых нервных волокон.

Как рассказала Наталия Гаврилова, исследование ученых СПбГУ должно значительно расширить знания о методе конфокальной микроскопии роговицы глаза. В том числе потому, что специалисты Университета собрали одну из самых многочисленных выборок пациентов: примерно 70 человек из разных городов России. В более ранних научных исследованиях крайне редко наблюдается такое количество пациентов.

«Пациент с фибромиалгией»: невозможно выделить ни одного ствола у нервного волокна, видны только ветви, очень много клеток Лангерганса.
«Пациент с фибромиалгией»: невозможно выделить ни одного ствола у нервного волокна, видны только ветви, очень много клеток Лангерганса.

«В целом мы хотим проанализировать, насколько совпадают данные биопсии кожи с данными конфокального микроскопа, и сравнить их с результатами лабораторных тестов. Также мы хотим выяснить, возможно ли использовать микроскопию как основную методику для определения нейропатии малых волокон без биопсии, — подводит итог Мария Лукашенко. — Если нам удастся осуществить хотя бы половину задуманного, в будущем эту методику можно будет использовать не только в диагностике аутоиммунных заболеваний».

По ее словам, конфокальная микроскопия пригодится врачам также в обнаружении патологий глаз у пациентов с сахарным диабетом. Такие больные наряду с характерными осложнениями в виде диабетической ретинопатии также могут страдать от поражений малых нервных волокон и нарушения их функций. Эти нарушения имеют другую клиническую картину, но их все равно можно будет выявить с помощью конфокального микроскопа.